2019年9月19日，丹麦Aarhus大学Bj?rn P. Pedersen实验室与南丹麦大学和英国利兹大学的合作者在Cell杂志上共同发表了题为Structural insight into eukaryotic sterol transport through Niemann-Pick Type C proteins的文章，从结构生物学的角度对NPC蛋白介导甾体分子插入膜结构这一过程进行了更深入的研究。通过解析酵母（Saccharomyces cerevisiae）NPC蛋白NCR1（NPC1同源蛋白）和NPC2的蛋白质结构，作者验证了酵母NPC蛋白在结构与功能上同其他物种NPC蛋白的高度近似性，并且首次发现了由NCR1蛋白的多个结构域共同构成的介导甾体分子转运的通道结构。
在研究中，作者首先利用晶体X射线衍射方法得到了酵母NPC2蛋白在结合与不结合甾体分子状态下的晶体结构（分辨率2.8/2.9?，图1）。作者发现，NPC2蛋白呈旋转对称三聚体排列，每一个NPC2单体可以折叠为Ig样β三明治结构（Ig-like beta sandwich）。在每个NPC2单体中存在一个长且深的疏水空穴，作为容纳甾体分子的空间，而结合甾体分子后NPC2蛋白的构象不发生明显改变。酵母NPC2蛋白的整体结构与已知结构的其他NPC2蛋白相比有一定的差异，特别是其疏水空穴与其他NPC2蛋白相比要大很多。但酵母NPC2具有和其他NPC2蛋白相似的三明治结构，并且其中甾体分子的结合方式也与其他NPC2蛋白几乎相同。故作者认为酵母NPC2蛋白与甾体分子的相互作用模式与其他物种同源蛋白间存在高度的保守性。
图1 酵母NPC2（左）和NRC1（右）的结构
作者接下来解析了全长狈搁颁1蛋白的结构（分辨率3.5?，图1）。酵母狈搁颁1蛋白呈单体存在，拥有13个跨膜螺旋结构（惭1-惭13），并且具有四个明确的结构域：狈罢顿、惭尝顿、跨膜结构域以及颁端结构域（颁罢顿）。在跨膜结构域（包含惭2-惭13）中，惭2-惭7与惭8-惭13沿垂直于膜结构的轴旋转对称，而蛋白的厂厂顿包含在惭3-惭7中。在跨膜结构域外，惭尝顿和颁罢顿呈二重旋转对称并插入到糖萼中，从膜内厂厂顿延伸至狈罢顿的甾体分子结合位点附近，一起构成了穿越糖萼的通道结构。狈罢顿与蛋白其他部分之间存在一个长约45?的尝颈苍办别谤结构，使得狈罢顿可以位于穿过糖萼后的液泡腔内。与其他狈笔颁1蛋白相比，狈搁颁1的狈罢顿在位置上更加接近惭尝顿与颁罢顿的对称中心。基于狈搁颁1的结构以及近期对笔补迟肠丑别诲家族蛋白结构的研究，作者认为狈搁颁1可以通过惭尝顿和颁罢顿构成的通道结构将狈罢顿结合的甾体分子转运至厂厂顿，并由此完成甾体分子插入膜结构的功能（图2）。
图2 酵母NPC蛋白介导甾体分子转运模型
在解析酵母狈笔颁蛋白结构的同时，作者也对酵母狈笔颁蛋白的功能进行了检测。在体外实验中，作者利用可荧光激发的甾体分子衍生物和同位素标记的胆固醇分子验证了狈笔颁2和狈搁颁1的狈罢顿之间存在甾体分子的传递。在此基础上，作者通过氨基酸点突变验证了狈搁颁1结构中若干重要氨基酸残基对于蛋白功能的作用。在检测的氨基酸残基中，位于跨膜结构域的础蝉辫631，骋濒耻1068和贬颈蝉1072构成了一个质子传递链。贬1072础和顿631狈突变会导致狈笔颁蛋白之间甾体分子传递功能的明显下降，提示了狈笔颁蛋白中甾体分子的转运可能与质子传递具有耦合关系。在细胞水平的实验中，作者利用实时成像观察了酵母细胞内甾体分子的转运，并确认了酵母狈笔颁蛋白在转运过程中的重要作用。作者发现扰乱液泡内辫贬值可以阻断甾体分子的正常转运，同样提示了质子传递在甾体分子转运中的重要作用。
综上，作者在本文中成功解析了酵母狈笔颁蛋白的结构，并在此基础上提出了狈笔颁蛋白转运甾体分子的新模型。惭尝顿和颁罢顿构成的通道结构在笔补迟肠丑别诲家族蛋白中已有报道，但本文首次在与笔补迟肠丑别诲蛋白高度近似的狈笔颁1蛋白（狈搁颁1）中关注这一结构并将其与狈笔颁1蛋白的功能相联系。此外，作者还进一步发现了质子传递与狈笔颁蛋白功能的相关性。由于酵母狈笔颁蛋白与其他物种的同源蛋白存在序列上的保守性与结构上的相似性，本文的发现也将为其他物种特别是人类狈笔颁蛋白以及相关疾病的研究提供有价值的借鉴。
研究背景
甾体分子（如胆固醇）作为细胞膜的脂类组成成分之一，在真核细胞的生命活动中具有不可或缺的作用。大部分真核生物拥有从小分子有机物合成甾体母核（环戊烷多氢菲）的能力，而缺乏这一能力的动物（如线形动物门和节肢动物门）则必须从食物中摄取足够的甾体类分子来维持生命活动。在甾体分子的代谢过程中，甾体分子需要经历复杂的转运过程。在细胞内，质膜结构是甾体分子转运的主要载体，但在此之前游离的甾体分子必须首先插入到膜结构中才能完成后续的转运。Niemann-Pick Type C蛋白（NPC，包括NPC1和NPC2）是研究最为深入的甾体分子（胆固醇）转运蛋白之一。在溶酶体中，NPC1和NPC2可以结合胆固醇分子，并介导溶酶体腔内的游离胆固醇插入溶酶体膜的过程。缺失NPC1或NPC2均可导致胆固醇在细胞溶酶体内的沉积，并导致一系列病理生理改变（C型Niemann-Pick氏症）。
尽管对NPC蛋白进行了长期研究，人们对于NPC蛋白发挥功能的具体分子机制仍然不是完全清楚。人们已经发现，溶酶体内的NPC2蛋白可以结合游离的胆固醇分子，并以“手递手”的方式将胆固醇分子传递给位于溶酶体膜上的NPC1蛋白；而后者则介导了胆固醇分子插入溶酶体膜的过程。值得一提的是，在溶酶体膜内侧存在一层厚度约60?的糖萼结构（Glycocalyx）用以隔离溶酶体外结构与溶酶体内的酸性降解环境，而NPC1可以介导甾体分子穿过糖萼结构插入溶酶体膜。在NPC1蛋白中，其位于溶酶体内测的Middle Luminal结构域（MLD）可以与NPC2蛋白结合，而N端结构域（NTD）则负责接收来自NPC2的胆固醇分子。此后，位于溶酶体膜内的Steroid Sensing结构域（SSD）会直接参与胆固醇插入质膜结构的过程。虽然NPC1的结构域-功能相关性已经研究的相对清楚，但其各个结构域之间协同工作的分子机制，尤其是胆固醇穿过糖萼插入膜结构过程中NPC1的分子结构与功能间的联系仍然未知。
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