2019年10月24日，中国科学院生物物理所王艳丽及马萨诸塞州大学医学院Erik J. Sontheimer共同通讯在Molecular Cell 在线发表题为“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR-Inhibited States”的研究论文，该研究报道了脑膜炎奈瑟氏球菌的两个Cas9同源物（Nme1Cas9和Nme2Cas9，II-C型）与sgRNA，dsDNA或抗CRISPR蛋白复合物的结构。 在Nme1Cas9的HNH催化状态下，可以看到活性位点保持在目标链的可裂解磷酸二酯键处，提供了活性构象的高分辨率视图。 HNH活性构象激活RuvC域。该研究结构解释了Nme1Cas9和Nme2Cas9如何读取不同的PAM序列以及AcrIIC3如何抑制Nme1Cas9活性。这些结构提供了对Cas9结构域重排，引导靶标参与，切割机制和抗CRISPR抑制的见解，从而有利于优化这些基因组编辑平台。
另外，2018年11月30日，中科院生物物理所王艳丽及章新政共同通讯在Cell 在线发表题为“Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference ”的研究论文，该论文报告了与crRNA复合的Csm结构以及同源或非同源靶RNA结合的Csm复合物的结构。总之，结构研究为crRNA介导的序列特异性RNA切割，RNA靶标依赖性非特异性DNA切割和cOA生成所需的机制过程提供了重要的见解。
Cas9是II型CRISPR-Cas系统蛋白，是一种RNA可编程的DNA核酸内切酶，可通过RuvC和HNH结构域切割靶双链DNA（dsDNA）。 CRISPR-Cas9保护细菌免受入侵核酸的侵害，并提供了革命性的RNA指导的基因组编辑平台。 Cas9的活性需要CRISPR RNA（crRNA），反式激活的crRNA（tracrRNA）和DNA靶位点中的原间隔子相邻基序（PAM）序列的指导。可以将crRNA和tracrRNA融合到单向导RNA（sgRNA）中。
狈尘别1-颁补蝉9-蝉驳搁狈础和狈尘别1-颁补蝉9-蝉驳搁狈础-诲蝉顿狈础复合物的整体结构
已经报道了具有不同结合形式的多个颁补蝉9结构。然而，在可用的顿狈础结合的，预先切割的颁补蝉9结构中，贬狈贬活性位点与肠谤搁狈础互补靶链（罢厂）的易分裂磷酸二酯相距较远，这表明贬狈贬结构域在确定的结构之前经历了显着的构象变化切割罢厂。要了解罢厂裂解的机制，包括通过酶检测足以进行核酸酶激活的骋耻颈诲别-罢厂互补性，阐明处于顿狈础结合状态的颁补蝉9复合物的催化能力至关重要。
完全互补的Nme1Cas9 sgRNA dsDNA复合物在催化状态下的结构
来自脑膜炎奈瑟氏球菌的两个Cas9同源物（Nme1Cas9和Nme2Cas9，II-C型）已被开发为基因组编辑工具。它们有1,082个氨基酸，都比常用的II-A型直系同源SpyCas9小（1,368个氨基酸），使得Nme1Cas9或Nme2Cas9以及sgRNA可以与单个腺相关病毒（AAV）载体一起被递送。 Nme1Cas9和Nme2Cas9的PAM相互作用（PI）域高度差异（52％相同），即使蛋白质的其他部分> 98％相同。这种差异导致了不同的PAM特异性：Nme1Cas9的N4GAYW / N4GYTT / N4GTCT和Nme2Cas9的N4CC（PAM序列在非目标链[NTS]上为5'至3'）。
两者也都可以被由流动遗传元件编码的抗CRISPR（Acr）蛋白抑制，这代表了控制Cas9的潜在强大的非开关策略。已经鉴定出五种抑制Nme1Cas9的抗CRISPR（AcrIIC1-AcrIIC5），除AcrIIC5Smu以外的所有抗体也均抑制Nme2Cas9。 Nme1Cas9和Nme2Cas9都能切割很少或没有脱靶的哺乳动物基因组。但是，尚未报告Nme1Cas9和Nme2Cas9的完整结构。
在这里，研究人员报告了Nme1Cas9和Nme2Cas9在5个不同功能构象中的结构：（1）Nme1Cas9-sgRNA，（2）Nme1Cas9与匹配的8 bp DNA结合，（3）Nme2Cas9-sgRNA在完全互补的DNA-结合但处于催化前状态，（4）Nme1Cas9-sgRNA处于完全互补的DNA结合和催化活化状态，（5）Nme1Cas9-sgRNA在TS切割后与完全互补的DNA结合。
文章总结
此外，研究介绍了与狈尘别1颁补蝉9-蝉驳搁狈础结合的有效的苍迟颈-颁搁滨厂笔搁结构（础肠谤滨滨颁3狈尘别），处于顿狈础未结合和顿狈础结合状态。狈尘别1颁补蝉9-蝉驳搁狈础-诲蝉顿狈础结构代表处于催化平衡状态的颁补蝉9直系同源物的第一个高分辨率图，其中大量读出了罢厂-罢厂异源双链骨架和位于罢厂可分裂磷酸埃内的贬狈贬结构域活性位点。这些研究将提供大量新的结构和机制见解，以应用于颁补蝉9蛋白家族。
研究背景
由于HNH核酸酶结构域的位置远离切割位点，高分辨率的Cas9结构尚未显示出催化构象。 Nme1Cas9和Nme2Cas9是用于体内基因组编辑的紧凑型核酸酶。Nme1Cas9和Nme2Cas9都能切割很少或没有脱靶的哺乳动物基因组。但是，尚未报告Nme1Cas9和Nme2Cas9的完整结构。
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